Anti-MASH1/Achaete-scute homolog 1 antibody (ab38557)

Muchas gracias por la oferta que me has hecho.
Solo estoy pendiente de hacer la inmunohistoquímica de esos tres anticuerpos para entregar y dar por finalizado un trabajo de muchas muestras, muchos otros anticuerpos y la biología molecular de todos ellos, por lo que te rogaría que me indicases tu la opción mas adecuada sustituyéndolos por los que consideres que esta garantizado su funcionamiento y que mejor funcione.
Muy atentamente.

ANSWER:

Gracias por tu respuesta.

Todos nuestros anticuerpos y demás productos están garantizados y deben funcionar en las aplicaciones y especies indicadas en la datasheet de los mismos. Por eso todos tienen una garantía de 6 meses que asegura que en el caso de no funcionar tal y como se especifica, se envía un reemplazo o reembolso.

Cualquiera de las opciones alternativas ofrecidas debería funcionaros, pero en cualquier caso, estos reemplazos gratuitos también están garantizados. Si te parece puedo mandarte un nuevo lote para el caso del anti-HES5, que tenemos actualmente en stock, y el producto alternativo para MASH1, el ab38556.

Como para anti-Hes1 existen varias opciones, si estás de acuerdo, os envío ab71559, que tiene varias publicaciones positivas enviadas por otros usuarios e imágenes de inmunos en secciones incluidas en parafina que os pueden ser útiles.

Una vez me confirmes las alternativas ofrecidas, procederé a realizar el nuevo pedido de forma gratuita.

Así pues, quedo a la espera de tu respuesta.

Muchas gracias por tu contestación,
No he mencionado el tiempo de fijación, puesto que los bloques, nos los proporciona el servicio de anatomía patológica, quefueron utilizados primeropara diagnostico y doy porsupuesto que el tiempo de fijación ya lo tienen estipulado para sus inmunohistoquimicas y que no excede de las 24 horas.
Una vez hecho el corte,algunos los he dejadotoda la noche en la estufaa 37ºC o enotras pruebas 2 horas a 60ºC. En el caso de los que puse a 37ºC toda la noche los pase a 60ºC durante 10 min. y despues todos al xilol, alcohol de 100º, alcohol 96º,alcohol 70ºy H2O para desparafinarlos e hidratarlos.
Para la recuperación antigénica he hecho casi todas las formas que he podido, los reactivos son comerciales a una concentración de 10X por lo que se supone que ya estan al pH adecuado, lo unico que tengo que añadirles es el agua, que es de botella esteril, tanto para esto como para cualquier otro reactivo que tenga que diluir para la inmuno.
Para la recuperación antigénica por calor tenemos el 2100 Retriever en el que todos los anticuerpos que pueden ser utilizados en los tejidos tratados con un horno de microondas se pueden utilizar en Retriever también.Reproducibilidad. No hay ninguna zona fría como suele occurir con un horno de microondas, cuando algunas de las secciones se calientan menos que otros. Todas las secciones se procesan de manera uniforme, siempre por el mismo tiempo. No hay variaciones de un ciclo a otro para que usted pueda comparar las secciones procesadas con meses (o años) de separación. Dado que el ciclo es totalmente automático, la calefacción de las secciones, la exposición a alta presión y temperatura, e incluso de refrigeración (también muy importante) son normalizados. Sus resultados lo son también.Calidad de los resultados. El Retriever preserva la morfología de los tejidos, por lo tanto, las imágenes serán de mucho mayor calidad. Para algunos antígenos encontramos que la intensidad de la coloración es mucho mejor que con los métodos estándar (especialmente para los antígenos nucleares, como el receptor de estrógeno).Su tiempo. Todo lo que tienes que hacer es poner las diapositivas en una cámara y pulsar el botón. Mientras la unidad está funcionando, usted no tiene que estar cerca, puede resolver otras cuestiones.
Para la proteinasa K he utilizado 10min que es como lo tengo optimizado para otros anticuerpos y para las hibridaciones in situ y por los resultados que dieron como puedes ver en alguna de las fotos que te mande no creo que se pueda conseguir variando ese tiempo.
Por lo del TritonX100, como puedes ver en alguna de las fotos, le he aumentado la concentración hasta el 3% y dejandolo toda la noche a una dilución 1:100 sale todo positivo en alguno pero al irlo diluyendo hasta 1:500para quitar fondo o dejandolo 1h se ve que aun sigue habiendo tincion citoplasmática pero desaparece la que "pudiera" ser nuclear.
Te he mandado dos fotos de otros anticuerpos que fueron hechos a la par de alguna de las pruebas que como puedes ver si salen nucleares y sin tinción de fondo.
Para el caso del anti-MASH te mando una foto de como me salio siguiendo lo publicado en el Abreview pero a una dilucion 1:50 en vez de 1:300 en la que se puede comprobar que estando mucho mas concentrado los nucleos se ven azules.
EnVision™ Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse es un polímero conjugado con peroxidasa, que también está recubierto de anticuerpos frente a las inmunoglobulinas de conejo y de ratón que gracias a un procedimiento de lavado eficaz y a la presencia de proteínas estabilizantes en los reactivos , los pasos de inhibición extra con el fin de reducir la tinción de fondo no específica no son necesarios o esto es lo que dice la casa.
Creo que antes de acudir a ti he intentado todo lo que se me ha podido ocurrir para conseguir que saliera y en modo de desesperación porque ya no se me ocurria mucho mas, mehe dirigido a ti.
Atentamente

ANSWER:

Muchas gracias por tu respuesta y facilitarnos detalles adicionales.

Siento mucho que los anticuerpos no hayan funcionado y las molestias ocasionadas. Después de estudiar el protocolo y atendiendo a las imágenes, estoy dispuesta a extender de manera excepcional la garantía de los tres productos.

Para la próxima vez sí que por favor os agradecería que reportarais las quejas dentro de los 6 meses de plazo estipulados en la garantía.

Lamentablemente únicamente en el caso del anti-HES5 tenemos un lote diferente al adquirido en stock. Para el anti Hes1 y anti MASH1 los lotes disponibles actualmente son idénticos a los ya testados.

Sin embargo existen otros anticuerpos contra las mismas proteínas que quizás os puedan interesar:

Para MASH1: http://www.abcam.com/Achaete-scute-homolog-1-antibody-ab38556.html

Para Hes1: http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=searchresults&search=Hes1&pt=1&sk=app&sv=74&sn=IHC-P&l=2&fViewMore=1

La garantía ofrece el reemplazo de los anticuerpos por otros similares o diferentes, o bien el reembolso del importe, o un vale sin caducidad para futuras compras con nosotros.

Así pues, quedo a la espera de que me indiques cual de las opciones os conviene más y estaré encantada de ayudaros a resolver este inconveniente.

Buenos dí,
como habíamos quedado te mando los cuestionarios y unas fotos de algunas de las pruebas que hice, espero quesirvan para queme podáis ayudar.
Muchas gracias

ANSWER:

Muchas gracias por enviarnos los detalles relativos al protocolo y las imágenes de las tinciones. Aparte de resultarnos útiles a nosotros para entender mejor el problema por el cual no se ha obtenido la tinción deseada, nos aporta información para monitorizar la calidad de nuestros productos, y mejorarla cuando es necesario.

Después de estudiar el protocolo, hay una serie de cosas que me gustaría sugerir para intentar mejorar el rendimiento del anticuerpo:

-No se menciona en el documento enviado el tiempo de fijación de los especímenes. No es recomendable fijar durante más de 24 horas para no dañar el tejido. Supongo que habréis llevado a cabo la eliminación de la cera de parafina antes de llevar a cabo la tinción, para rehidratar las secciones sumergiéndolas en sucesivas soluciones de alcoholes.

-Respecto a la recuperación antigénica, éste es un paso crucial en el tratamiento de las secciones. Es importante que los buffers estén al pH adecuado, y para optimizar este paso recomendaría probar distintos tiempos de recuperación, comprendidos entre los 3 y los 10 minutos, y si no fuera suficiente probar con tiempos mayores de hasta 20 minutos. Más de 20 minutos puede alterar la morfología de las secciones.

Os recomiendo probar como buffer de recuperación Tris EDTA. Quizás nuestro protocolo de recuperación antigénica pueda ser de ayuda:

http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=11488

-Dado que las tres proteínas son nucleares, y la tinción obtenida es más bien citoplasmática, puede que al aumentar el porcentaje de detergente TritonX100 (a 0.25%, por ejemplo) facilite el acceso del anticuerpo al epítopo.

En el caso del anti-MASH, sin embargo, en el Abreview publicado por otro usuario usando este anticuerpo en IHC-P satisfactoriamente, se indica que no es necesario permeabilización.

http://www.abcam.com/index.html?datasheet=38557&tab=abreviews&intabreviewid=27494

-A modo de confirmación, ¿el kit Envision contienen un agente de bloqueo de uniones no deseadas, no es así? Si no fuera así, es posible que el resultado mejore al bloquear, usando 5% BSA durante una o dos horas a TA.

Confío en que estas recomendaciones puedan mejorar los resultados. En caso contrario, y dado que os he extendido la garantía (de manera excepcional), podría enviaros un reemplazo o reembolso de los productos.

Quedo a la espera de tu respuesta. Para cualquier otra consulta no dudes en volver a contactarnos.

I checked your website for an other Mash1 possibility.
Unfortunately there is no AB available.
Could we get just a credit note about the AB price for further orders
from you?
So I can forward this to our technican who´s ordering stuff for our
lab.

ANSWER:

Thank you for your email. Please find the information about the credit below.

Your credit note ID is xxx.

I am sorry that this antibody did not perform as stated on the datasheet, I have asked our Finance department to issue a credit note for you. The credit note may be used in one of the following ways:

(1) Redeemed against the original invoice if this hasn't already been paid.
(2) Held on the account for use against a future order.
(3) A full refund can be offered where no other invoices are outstanding.

Please contact your Finance department to confirm how you would like the credit note to be used and ensure it is not redeemed without your knowledge.

To specifically receive a refund please ask your Finance department to contact our Finance department at creditcontrol@abcam.com or by telephone using the information at the “Contact Us” link in the top right corner of our website.

The credit note ID is for your reference only, please refer to the credit note ID in any correspondence with our accounting department. We will send you the completed credit note by email or postal mail with the actual credit note number which will start with the letters CGB.

I hope this experience will not prevent you from purchasing other products from us in the future. Our Scientific Support team is always at your service should you require further expert advice.

thanks a lot for answering.
Regarding to your questions:
1) What is the actual problem (e.g. no staining, high background)?
no staining at all
2) How were your samples prepared (e.g. fresh frozen or perfused frozen)?
the samples are perfused / frozen cutted using a sliding microtome
3) What antibody dilution and incubation time have you tried?
AB dilution 1:150 ON at 4°C (as the reference)
4) Wha was used for blocking?
blocking solution contains 8% donkey serum 2% Triton X-100 in TBS
5) Which detection system was used and is this working well otherwise?
commonly used secondary ABs - donkey anti-rbt 555 and 647 with
subsequent fluorescence microscopy
detection system works well (also the used sec.ABs in other staining
I performed recently)
I tried nucleus permeabilization with DNA denaturation using 1.5N HCl
(30min at 37°C) as well, because I like to stain BrdU and Mash1
together.
I attached the reference paper to this mail...

ANSWER:

Thank you for your detailed reply. I am sorry to hear this antibody is not providing satisfactory results.

The details provided will enable us to investigate this case and will provide us with vital information for monitoring product quality. I appreciate the time you have spent in the laboratory and understand your concerns. It is regrettable that the results have not been successful.

Having reviewed the protocol details, I believe this product should have given satisfactory results. It appears that you may have received a faulty vial.

I apologize for the inconvenience and am pleased to offer you a free of charge replacement, credit note, or refund in compensation. Unfortunately, we do not have a different lot in stock for ab38557. But the free of charge replacement can be given for another antibody of the same or a different target.

Please let me know which option would be best for you, and how you would like to proceed.